O uso de probióticos como os Bacilli aumentou consideravelmente na produção animal nos últimos 25 anos. Probióticos são bactérias vivas que quando administradas em quantidade adequada, conferem efeitos fisiológicos benéficos ao hospedeiro, resultando em melhorias na saúde e no desempenho.

A morfologia dos Bacilli e a germinação dos esporos

Os Bacillus apresentam duas formas distintas: endósporos (esporos) e células vegetativas (germinadas), dependendo das condições ambientais. Os Bacilli são administrados aos animais como esporos na dieta, podendo resistir às condições desafiadoras do processamento da ração e de seu armazenamento prolongado.

Os esporos são metabolicamente inativos e formados em resposta a tensões ambientais, como mecanismo de sobrevivência. São formas não reprodutivas de bactérias, mais duráveis e viáveis já conhecidas. Os esporos são resistentes e podem sobreviver à radiação UV, temperatura e pressão extrema, exposição a produtos químicos tóxicos e acidez.

Após ingestão pelo animal, um esporo precisa germinar e crescer para se tornar metabolicamente ativo e assim, promover seus benefícios ao animal. A germinação ocorrerá na presença de germinantes que se ligam a receptores específicos na membrana interna. Os esporos de Bacillus têm uma variedade desses receptores, permitindo a ligação a vários tipos de germinantes, nutrientes ou não nutrientes, e condições ambientais favoráveis (temperatura, pH…) (Figura 1). Quando um sinal forte o suficiente é gerado, a germinação começa. Os receptores também podem ser inibidos, mas uma vez completamente ativados, o processo de germinação é irreversível.

Figura 1: Germinação de esporos de Bacillus

Ao contrário dos esporos, as células vegetativas se dividem, se multiplicam, se comunicam e são móveis. Elas são metabolicamente ativas e produzem metabólitos, proporcionando efeitos completos do probiótico no hospedeiro.

Todos os probióticos germinam dentro do trato digestivo dos animais?

Alterion® é o único probiótico disponível no mercado cuja germinação foi demonstrada e visualizada dentro das aves.

Alterion® é uma cepa exclusiva natural de Bacillus subtilis, selecionada especificamente para promover um desempenho consistente em aves. Alterion® é o resultado de uma seleção rigorosa, onde mais de 900 cepas listadas na AAFCO (The Association of American Feed Control Officials) foram rastreadas e testadas em condições in vitro e in vivo.

O Bacillus subtilis 29784 (Alterion®) foi cuidadosamente selecionado para fornecer segurança, estabilidade, eficácia e funcionalidades superiores.

Alterion® não contém genes de resistência aos antibióticos utilizados em medicina humana e é inofensivo às células animais. Ambos são parâmetros essenciais para garantir a segurança do produto e para preservar a saúde e o bem-estar dos animais.

A triagem também foi baseada em vários testes para garantir a seleção da cepa mais estável (em condições adversas de peletização, condições digestivas e armazenamento prolongado) e mais eficiente em termos de características de germinação.

Além disso, os esporos de Alterion® são especialmente “colados” em partículas de carbonato de cálcio. Essa formulação inovadora garante redução da produção de pó, baixa segregação dos esporos, evita problemas de desmistura e favorece uma excelente fluidez e homogeneidade no premix e na ração.

A germinação do Alterion® foi comprovada in vitro e, o mais importante, visualizada in vivo.

A capacidade da maioria das cepas de Bacillus de germinar e crescer in vivo é desconhecida. Devido à complexidade do processo de germinação, especialmente em um ambiente muito complexo, ou seja, o conteúdo do lúmen digestivo, a confirmação in vivo da germinação continua sendo uma tarefa desafiadora.

Ao unir seus conhecimentos em produção animal e em soluções biológicas, a Adisseo e a Novozymes conseguiram investigar a germinação e crescimento de Alterion® em profundidade, usando uma variedade de métodos inovadores complementares, como monitoramento in vitro, tecnologias fluorescentes e avaliação metabólica in vivo.

Germinação In vitro

A cepa de Alterion® foi selecionada com base em suas capacidades superiores de germinação em condições intestinais e de alimentação (Figura 2).

Figura 2: Germinação do esporo de Alterion® em condições intestinais em 0, 4 e 6 horas

Em um estudo preliminar, Alterion® foi cultivado in vitro juntamente com uma variedade de componentes e aditivos para a alimentação, a fim de avaliar seus impactos na velocidade de germinação por meio da densidade óptica (DO).

O perfil de germinação do Alterion® foi similar ao longo do tempo nas avaliações com trigo, milho e soja (Figura 3). Além disso, a inclusão de ácidos orgânicos, coccidiostáticos e uma variedade de aditivos não mostrou impacto na germinação.

Figura 3: Perfil da Germinação do Alterion® na presença de diferentes componentes da ração

A cinética da germinação do Alterion® também foi comparada in vitro com outras cepas de Bacillus. Comparar outra cepa de Bacillus subtilis e uma de Bacillus licheniformis em condições semelhantes demonstrou claramente que a cinética da germinação varia imensamente entre as cepas, mostrando a superioridade do Alterion® (Figura 4).

Figura 4: Cinética da germinação de diferentes cepas de Bacillus

Visualização da germinação in vivo

A germinação do Alterion® foi observado por meio do desenvolvimento de um sistema único e inovador de dois indicadores fluorescentes que rastreia o processo de germinação no intestino da ave. O primeiro passo consiste na integração de marcadores fluorescentes no genoma do Alterion®, mais especificamente dois genes, um deles codifica a proteína verde fluorescente (PVF) e o outro codifica a proteína fluorescente vermelha (dsRed); assim, emitindo um sinal verde para um esporo dormente e um sinal vermelho após germinação e crescimento, respectivamente.

Após a incorporação dos marcadores, a fluorescência foi verificada por análise microscópica. Uma placa de 96 poços foi inoculada com esporos de Alterion® e a fluorescência foi observada, como mostrado na Figura 5. Os esporos adormecidos de Alterion® podem ser visualizados na cor verde. Após a germinação, a fluorescência verde desapareceu rapidamente e as células germinadas fluoresceram em vermelho.

Figura 5: Fluorescência dos esporos e das células germinadas do Alterion® observada por microscópio em diferentes tempos

O terceiro passo consistiu em visualizar a germinação no intestino da ave.

Para verificar a germinação de Alterion® em condições in vivo, foi realizado um estudo durante 13 dias. As aves foram alimentadas com uma dieta controle ou tratamento, à qual foram adicionados esporos Alterion® com dupla marcação 72 horas antes do abate. No final do estudo, o conteúdo do íleo foi amostrado, analisado e processado pelo InCell Analyzer para verificar a fluorescência nas amostras. A cor vermelha indica que a maioria dos esporos germinou e está crescendo ativamente para produzir os efeitos benéficos à saúde em frangos de corte (Figura 6).

Células germinadas de   Alterion®

Figura 6: Germinação visualizada por fluorescência vermelha em amostras ileais

Produção de metabólitos in vivo

Uma abordagem complementar para investigar a atividade in vivo de Alterion® após a germinação e crescimento é monitorar sua produção de metabólitos. Os metabólitos de Alterion® foram estudados in vitro e três metabólitos foram identificados como produzidos em quantidades altas e consistentes (niacina, pantotenato, hipoxantina). A concentração desses metabólitos foi então medida no conteúdo digestivo das aves alimentadas com Alterion®. O estudo mostrou claramente que a concentração dos metabólitos estava fortemente relacionada ao número de bacilos detectados (Figura 7).

Figura 7: Percentual relativo de Bacillus spp. e concentração de metabólitos (fezes nmol/g) em aves suplementadas com Alterion® versus aves controle.

Claramente, esses dados confirmam que Alterion® é ativo no intestino das aves.

Favorecendo a resiliência animal em três linhas de defesa

A atividade metabólica do Alterion® no intestino é responsável pelos efeitos benéficos in vivo no desempenho, na saúde e na microbiota do hospedeiro (Jacquier et al., 2019).

Uma vez germinado e ativado, o Alterion® favorece a resiliência animal agindo em três linhas de defesa intimamente conectadas: 1) promovendo um microbioma resiliente, 2) fortalecendo a função de barreira e preservando a integridade intestinal e, finalmente, 3) garantindo um ótimo controle inflamatório e das respostas imunes.

Estudos in vivo mostraram que Alterion® influencia positivamente as populações bacterianas, resultando em um efeito benéfico na atividade microbiana. Por exemplo, Alterion® aumenta as populações que degradam polissacarídeos, bem como as de bactérias produtoras de butirato (Jacquier et al., 2019).

Mostrar que Alterion® é ativo também in vivo nos permite confiar em dados in vitro (Rhayat et al., 2017). Alterion® fortalece a barreira intestinal aumentando a expressão de proteínas das “tight junctions”. Além disso, reforça e controla a resposta inflamatória pela inibição da degradação de IkB, impedindo assim a translocação de NF-κB. Com isso, a expressão de compostos pró-inflamatórios como a IL-8 e a enzima iNOS é controlada (Rhayat et al., 2019).

Conclusão

A características únicas desta cepa de Bacillus, somadas à formulação e sua germinação adequada, tornam o Alterion® metabolicamente ativo onde é mais importante: no intestino das aves. Aqui ele produz seus metabólitos e atua nas três linhas de defesa: microbiota,  mucosa intestinal e respostas inflamatórias para promover a resiliência animal.

Este probiótico de eficácia cientificamente comprovada produz melhorias significativas e consistentes na saúde intestinal, no desempenho produtivo e na utilização dos alimentos pelas aves. Dessa forma, podemos utilizar os recursos naturais de uma forma mais responsável para melhorar a sustentabilidade da produção animal.

Aurélie MOAL – Gerente de Marketing, Saúde através da Nutrição, Adisseo
Estelle DEVILLARD – Gerente de P&D, Saúde através da Nutrição, Adisseo
Karoline SIDELMANN BRINCH – Gerente Científica em Pesquisa Aplicada, Novozymes